改変されたガイドRNAは、CRISPRシステムが遺伝子活性をより効率的に抑制するのに役立ちます

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ビデオ: ゲノム編集とCRISPR/Cas9が8分でよくわかる動画 2023, 1月
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改変されたガイドRNAは、CRISPRシステムが遺伝子活性をより効率的に抑制するのに役立ちます
Anonim
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ジャーナルCellに掲載された研究によると、Cas13タンパク質とガイドRNAに基づく遺伝子活性を抑制するシステムは、RNAヌクレオチドを化学的に修飾する際に最大80%効率的に機能します。細胞内の分子の効率と寿命の増加は、メチル化、硫黄の添加、またはガイドRNAの3 '末端への逆チミジンによって示されました。改変されたRNAは、SARS-CoV-2遺伝子領域および初代ヒトTリンパ球内でもテストされ、そこでも有効であることが証明されました。

短期間で、CRISPR / Casゲノム編集システムは多くの生物学的および医学的研究の不可欠な部分になりました(これについては「これらの手紙を覚えておいてください」という資料に詳しく書いています)。研究者のエマニュエル・シャルパンティエとジェニファー・ダウドナは、細菌の免疫系におけるこのメカニズムの発見により、2020年にノーベル賞を受賞しました。 CRISPR / Casの主な利点は、システムがゲノムの特定の領域にギャップを作り、そこに新しい配列を含めたり、古い配列をノックアウトしたりできることです。このメカニズムは、システムの2つのコンポーネント、つまりシステムを細胞のDNAの特定の領域に「導く」短いガイドRNAと、その領域にギャップを導入するCas9タンパク質によって可能になります。

しかし、遺伝子工学者の目標は、DNAの直接的な切断だけではありません。多くの場合、科学者は遺伝子の配列を破壊することによって恒久的に破壊するだけでなく、その働きを一時的に抑制する必要があります。このため、システムは、特定のmRNA分子(遺伝子の産物)を検出および抑制することができるCRISPR / Casシステムに基づいて作成されます。したがって、細菌免疫の別のタンパク質であるCas13は、mRNAに標的を定めた切断を導入し、その分解に寄与することができます。 Konstantin Severinovが率いるロシアの生物学者は、Cas13フォームの1つであるC2c2に基づくシステムの開発に参加し、インタビューでこの発見についてN +1に話しました。

しかし、今のところ、遺伝子を「オフにする」そのようなシステムは、短時間しか機能しません。重要なのは、ガイドRNA CRISPR / Cas13は、遊離核酸に対する細胞防御システムの影響下で時間の経過とともに分解するということです。ヌクレアーゼ酵素はそのような分子を分解して、ウイルスや他の病原体から保護します。

Alejandro Mendez-Mancillaが率いるニューヨーク市ゲノムセンターの科学者たちは、CRISPR / Cas13ガイドRNAシステムの安定化を試みました。これを行うために、彼らはそのヌクレオチドの4種類の化学修飾を使用しました:RNAの終わりの3つのウラシルへの硫黄、メチル、または両方のグループの導入、および終わりへの逆チミジンの追加。使用されたすべての修飾は、細胞内のRNAの安定化におけるそれらの有効性をすでに示しています。

修飾された配列は、細胞表面受容体の遺伝子でテストされました:CD46、CD55、CD71。ガイドRNAは、Cas13dを発現するトランスジェニックヒト細胞株の核に導入されました。 3日後、フローサイトメトリーを使用して、受容体遺伝子のmRNAレベルを細胞内でチェックしました。通常の未修飾のmRNAの場合、その影響はほとんど目立たなかった-細胞内にはまだ多くのmRNA受容体があった。しかし、それぞれの変更は、遺伝子抑制の効率の増加を示しました(p <0,0001)。メチル化されたウラシルを含むガイドRNAが最も効果的で、CD71 mRNAの最大80%を除去しました。しかし、この修飾の効果は遺伝子間でそれほど安定していませんでした。逆チミジンの添加はより安定していることがわかりました-すべての遺伝子で約55パーセント。

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ガイドRNAとコントロールの4種類の修飾のための表面受容体の3つの遺伝子の働きの抑制の結果

生物学者もガイドRNAの他のヌクレオチドを修飾しようとしましたが、これは何の結果ももたらさず、明らかに複合体とmRNAの相互作用を破壊しました。ただし、他のヌクレオチド修飾のテストでは、分子の末端にホスホロチオエートヌクレオチドを追加することも効果的であることが示されています。研究者たちは、ヌクレオチドへの修飾がエキソヌクレアーゼの影響からRNAを救うと信じています。

改変されたRNAは、治療用途での有効性についてテストされました。生物学者は、SARS-CoV-2コロナウイルスのRNA配列に基づいて人工RNAを開発し、新しいアプローチで破壊しようとしました。最後にホスホロチオエートを含むガイドRNAは、「ウイルス」RNAの量が約70%減少したことを示しました。

CRISPRシステムを使用する際のもう1つの重要な問題は、細胞へのタンパク質の送達です。これは、Cas13遺伝子を遺伝子組み換えして細胞に挿入するのはそれほど簡単ではありません(説明した実験の細胞のように)。生物学者は、細胞に配置する前に、RNA-タンパク質複合体の集合体で修飾されたRNAをテストしました。最初に、生物学者は、複合体の効率的な組み立てと送達のための条件(温度、バッファー、タンパク質の量、およびその中の核局在化シグナルの存在)を選択しました。次に、彼らはテストのために健康なドナーから初代Tリンパ球を分離しました。研究されたリンパ球のCD4 +およびCD8 +集団では、改変ガイドRNAを使用した後、標的遺伝子の発現の減少が60〜65パーセント観察されました。

CRISPR / Cas9に基づいてますます多くの新しい遺伝子工学ツールが作成されています。たとえば、最近の研究者は、エピゲノム(DNAメチルタグのコレクション)を編集する方法を考え出しました。 CRISPRoffシステムは遺伝子活性を抑制することもできますが、遺伝子をメチル化することで抑制し、転写酵素を取得する可能性を低くします。

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