遺伝学者は、「はさみ」なしでDNAのすべての点突然変異を修復することを学びました

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ビデオ: 39 高校生物「DNA修復」 2023, 1月
遺伝学者は、「はさみ」なしでDNAのすべての点突然変異を修復することを学びました
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Anonim
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実験で使用した大腸菌デアミナーゼTadA

遺伝学者は、DNA分子の両方の鎖を切断する必要がなく、A-TヌクレオチドペアをG-Cペアに変換することで変異を「ロールバック」できるゲノム編集ツールを作成しました。それ以前は、そのような編集者はG-CからA-Tのペアのみを変更できました。つまり、変異バリアントの半分しかカバーしていませんでした。作品はジャーナルネイチャーに掲載されました。

ヒトDNAの疾患を引き起こす変異の約半分は、シトシン(C)ヌクレオチドからのアミノ基の自発的な分離(脱アミノ化)に関連しており、C-GペアがT-Aペアに置き換わります。次に、アデニンの脱アミノ化は、ポリメラーゼによってグアニンとして認識されるイノシンの出現につながり、この反応は、C-GからT-Aへの変換を「ロールバック」する方法である可能性があります。しかし、これまで、DNA中のアデニンをうまく脱アミノ化できる酵素はありませんでした。科学者は、改変されたCRISPR-Cas9システムに「ステッチ」されたtRNAアデニンデアミナーゼに基づいてアデニンベースエディター(ABE)を作成することにより、それらを開発することができました。この場合、システムは正しいDNA配列を見つけるために必要です(CRISPR関連のゲノム編集方法の詳細については、当社の資料を参照してください)。

最も一般的なベースエディタは、C-GペアをT-Aペアに変換することができます。それらはいくつかのコンポーネントで構成されています。変更されたCRISPR-Cas9システムは、DNAを二本鎖で切断することはできませんが、目的の部分を見つけることができます。一本鎖「バブル」の5ヌクレオチドウィンドウでシトシンをウラシルに置き換えることができるシチジルデアミナーゼ。これにより、DNA上にCas9タンパク質が生成されます。ウラシルグリコシラーゼの阻害剤は、ウラシルの切除や編集製品の純度に影響を与える他の多くのプロセスを妨害します。システムのニッカーゼ活性はまた、グアニンをアデニンに置き換えるDNA修復システムの働きを活性化するために、編集不可能な「反対側」のDNA鎖に一本鎖切断を行うことを可能にします。このような編集者は、マウス、植物、酵母、魚、さらにはヒトの胚のゲノムでうまく機能します。それらは機能するためにDNAテンプレートを必要としません。あなたはここでそれらについてもっと読むことができます。

同様のエディターを作成するために、ATをGCペアに変換するために、ハーバードとMITの科学者は、遊離アデニン、アデノシン、RNA中のアデノシン、およびペアのRNA-DNAヘテロ二重鎖。それらはプラスミドを使用して細菌細胞に導入され、それらの活性が研究された。元の形では、どの酵素も二本鎖DNAのアデノシンを効果的に脱アミノ化できないことが判明しました。

科学者たちは、厳密に定義された条件下で自然淘汰を模倣するタンパク質工学と定向進化の方法を使用してきました。彼らは、抗生物質耐性遺伝子に変異がある細菌を扱った。それらは抗生物質で処理され、それらに対する耐性は、ゲノム編集(耐性遺伝子の修復)が成功した細菌で発生しました。最良の結果は、tRNAデアミナーゼTadAによって示されました。酵素の効率を上げるために、いくつかの変更が行われました。特に、選択段階では、DNAの処理を成功させるには、対応する遺伝子のD108位置に変異が必要であることが示され、そのような変異が導入されました。それ。さらに、とりわけ、酵素の効率は、その二量体化の場合に増加することが判明した。

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効率的なゲノムエディターを取得するための定向進化スキームと哺乳類細胞へのそれらの導入

その結果、第7世代では、科学者は効率的なエディター(ABE7.10)を受け取り、必要なA-Tペアを最大50%の効率でG-Cペアに置き換えました。この場合、サイドの挿入と削除のレベルは、平均して0.1%以下でした。 CRISPR-Cas9システムに基づくより一般的なゲノム編集方法は、DNA鎖に二重切断を導入することを含み、このプロセスは、原則として、より多くの側方挿入および欠失を生成します。さらに、ABEを使用した編集は、ターゲット外の置換が少なくなるため、より正確であることがわかりました。

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ABE編集者の仕事のスキーム

科学者たちは、病気の原因となる突然変異の編集におけるABEの有効性を実証する実験を個別に実施しました。ベータグロビン遺伝子の変異は、さまざまな血液疾患を引き起こすことが知られています。しかしながら、それらの保因者のいくつかは、ガンマグロビン遺伝子のプロモーター領域の突然変異のためにそれらに耐性があります。科学者たちは、ATをG-Cに置き換えて、これらの領域に突然変異を導入する特定のABEエディターを開発しました。 HEK293T細胞の2つのプロモーターで29%と30%の効率を示しました。

同様の実験が、ヒトにヘモクロマトーシスを引き起こす突然変異であるHFE遺伝子を用いて行われた。酵素は28%のケースで正常に機能し、遺伝子の845番目のヌクレオチドを置き換え、それに応じて、対応するビームのアミノ酸をチロシンからシステインに変更しました。

科学者たちは、シトシンからチミンまたはウラシルへの変換は、すべてのヒト細胞で1日に100〜500回発生することに注目しています。このプロセスは、DNAの重要な領域に突然変異を引き起こし、さまざまな遺伝病を引き起こす可能性があります。 ATとG-Cペアの両方の場合に、元のDNA配列を再構築できるゲノムエディターを入手することは、遺伝子工学手法にとって重要なステップです。

ここで、C-GペアをT-Aペアに変換するヒト胚とエディターを使った最初の実験について学びます。

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